Recognition of a multiple antigen peptide containing sequence from mimotope of the dengue type 3 virus NS4B protein by human antibodies.

OBJECTIVE: To evaluate the recognition of NS4B mimotope, as multiple antigen peptide (MAP), by dengue antibodies presents in serum samples from patients with different serotype infections. METHODS: A MAP containing mimotope sequence was synthesized and used to evaluate the recognition of NS4B mimotope as MAP by a panel of 66 human sera from dengue cases by an indirect ELISA assay. RESULTS: The MAP differentiated between sera from dengue viruses infected patients and sera from healthy individuals and the best reactivity was shown by serum from dengue type 3 virus patients. The recognition was more intense with serum from patients with secondary infection. CONCLUSIONS: The findings suggest the potential use of NS4B mimotope on the development of a multi-epitope diagnostic tool. These results are important for further immunogenicity studies.

A novel monoclonal antibody to Neisseria meningitidis serogroup X capsular polysaccharide and its potential use in quantitation of meningococcal vaccines.

A novel murine hybridoma monoclonal antibody (MAb) was produced against the capsular polysaccharide (CP) of Neisseria meningitidis serogroup X (MenX) in order to develop a sandwich enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the quantitation of the meningococcal polysaccharide. The MAb only reacted with the CP from MenX and did not react with CPs from N. meningitidis serogroups A, C, Y and W (MenA, MenC, MenY, MenW). The affinity constant (Ka) of the MAb measured by non-competitive ELISA was 7.25 × 10(7) M(-1). The application of this MAb in a sandwich ELISA was demonstrated by its ability to properly quantitate three lots of an experimental meningococcal CP-based vaccine. The MAb obtained in this work could be a valuable reagent for the detection and quantitation of future meningococcal vaccines containing MenX CP.

Development of four sandwich ELISAs for quantitation of capsular polysaccharides from Neisseria meningitidis serogroups A, C, W and Y in multivalent vaccines.

Neisseria meningitidis is a Gram negative bacterium that has been classified in 13 serogroups according to the biochemical composition of the capsular polysaccharide (CP). However, invasive infections are most frequently caused by six of these serogroups: A, B, C, W, X and Y (MenA, MenB, MenC, MenW, MenX, MenY). Individual CP quantitation in multivalent meningococcal CP-based vaccines is required for quality control testing of these products. In this regard, four sandwich enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) were developed for the quantitation of CP. The quantitation and detection limits of the four ELISAs were below 1ng/mL. The assays showed good reproducibility and repeatability as calculated for each point of the standard curve (CV<15%). In addition, five multivalent meningococcal CP-based vaccines were evaluated and the proposed ELISAs showed that these vaccines were found into the accepted range (±30%) of CP content. These assays are suitable for screening multiple plain or conjugated meningococcal CP-based vaccines and could be useful for monitoring lot-to-lot consistency and stability analysis.

Predicción de epítopos T y B de la proteína NS4b del virus dengue tipo 3 / T and B epitope prediction of protein NS4b of dengue virus type 3

El dengue se considera una enfermedad emergente y la principal de las afecciones virales transmitidas por artrópodos en términos de morbilidad y mortalidad. A pesar de los múltiples esfuerzos realizados por la comunidad científica internacional, aún no existe una vacuna licenciada contra esta entidad. La NS4b, una de las más pequeñas proteínas del virus del dengue induce respuesta de anticuerpo y de inmunomediadores en pacientes infectados por este virus. Sin embargo, poco es conocido sobre su estructura antigénica. En el campo de diseño de vacunas es muy útil la aplicación de las técnicas in silico, tanto para el descubrimiento y desarrollo de vacunas nuevas como para las existentes. Numerosos epítopos predichos se han verificado experimentalmente, lo que demostró la utilidad de tales predicciones. En este trabajo fueron aplicados los programas de predicción: BcePred, ABCpred, HLApred, ProPred y Proped1, para la búsqueda de nuevos epítopos de la proteína NS4b del virus dengue tipo 3. Se identificaron 27 epítopos de células B y 126 de la T. La secuencia de aminoácidos del mimotopo de la proteína NS4b (FEKQLGQV) fue predicha como epítopo B por el servidor Bcepred, con la puntuación más alta. El análisis teórico de la potencialidad del epítopo T-FEKQLGQV tuvo una alta cobertura para ser presentado por una muestra de la población cubana. Del total de epítopos T predichos, 13 resultaron promiscuos, que pudieran ser potenciales candidatos vacunales. La importancia de estos resultados radica en sentar las bases moleculares para el desarrollo de una vacuna profiláctica de subunidades(AU)

Dengue is considered an emerging infectious disease and the most important arthropod-borne viral disease in terms of morbidity and mortality. Despite the efforts made by the international scientific community, there is still no licensed vaccine against dengue. NS4b, the smallest hydrophobic proteins of dengue virus, has been reported to elicit antibodies and chemokines and cytokines in dengue-infected patients, but not much is known regarding the antigenic structure of this protein. In the field of vaccine design, the application of in silico techniques is very useful, for both the discovery and development of new and existing vaccines. Many predicted epitopes have been experimentally verified, demonstrating the usefulness of such predictions. In the present work, prediction programs: BcePred, ABCpred, HLApred, ProPred y Proped 1 were used to find novel epitopes from NS4b dengue virus type 3. 27 B-cell epitopes and 126 T-cell epitopes were identified on NS4b protein. The amino acidic sequence (FEKQLGQV) of NS4b protein was predicted by Bcepred server with a high score. Theoretical analysis of the potential of the T epitope -FEKQLGQV- showed a high coverage to be presented so that a sample of the Cuban population was used. Thirteen epitopes T out of those predicted resulted promiscuous, which can be potential vaccinal candidates. The importance of these epitopes is that they are identified main targets for the development of a subunit vaccine for prevention of dengue disease(AU)

Four monoclonal antibodies against capsular polysaccharides of Neisseria meningitidis serogroups A, C, Y and W135: its application in identity tests.

Murine hybridoma monoclonal antibodies (MAbs) were produced against the capsular polysaccharide (CPs) of serogroups A, C, W135 and Y meningococci (MenA, MenC, MenW, MenY) in order to develop immunological reagents for the identification of meningococcal polysaccharides. Each serogroup-specific MAb reacted with the CPs from its homologous serogroup only and did not react with CPs from the other three serogroups. The affinity constant (Ka) of the four MAbs measured by non-competitive ELISA was 6.62 × 10(9), 2.76 × 10(9), 1.48 × 10(9) and 3.8 × 10(9) M(-1) for MenA, MenC, MenW and MenY MAbs respectively. The application of these MAbs for identity tests was demonstrated by their abilities to correctly identify the CPs from serogroups A, C, W135 and Y in meningococcal CPs-based vaccines through ELISA. The MAbs obtained in this work are a very valuable set of tools for study meningococcal polysaccharides vaccines.

Cromatografía de exclusión molecular como metodología para la purificación de bacteriófagos / Molecular exclusion chromatography as methodology for the purification of bacteriophages

La cromatografía de exclusión molecular puede ser usada para purificar fagos filamentosos, el virus bacteriano más usado en la tecnología de presentación de péptidos y proteínas en la superficie de los fagos. El bacteriófago, luego de ser precipitado del sobrenadante de cultivo con polietilenglicol, fue aplicado a una columna de Sepharose CL-4B de 100 cm de altura, usando como fase móvil solución tampón fosfato (PBS). Se obtuvo un 61,3 por ciento de recobrado del fago total aplicado y, mediante el análisis por SDS-PAGE, se verificó la pureza de estas preparaciones. La cromatografía de exclusión molecular es una metodología atractiva para la obtención de preparaciones de bacteriófagos con alta pureza(AU)

Molecular exclusion chromatography can be used to purify filamentous phages which are the most commonly used virus in phage display technology of peptides and proteins. Bacteriophages were precipitated from culture supernatant using polyethylene glycol and they were loaded in a 100 cm high CL-4B Sepharose matrix using phosphate buffer as mobile phase. We recovered 61,3percent of total phage loaded. SDS-PAGE analysis showed a high purity of these preparations. Molecular exclusion chromatography is an attractive alternative method for purifying filamentous phages(AU)

Ensayo de neutralización in vitro de aplicación en la evaluación de inmunógenos contra la hepatitis A, obtenidos mediante la tecnología de expresión en fagos filamentosos / In vitro neutralization assay to evaluate new hepatitis A vaccine candidates

La inmunidad contra el virus de la hepatitis A (VHA) se debe en primera instancia a la inducción de anticuerpos neutralizantes. Disponer de ensayos de neutralización es indispensable para evaluar nuevos candidatos vacunales contra este patógeno. En el presente trabajo se desarrolló un ensayo de neutralización in vitro que permitió evaluar la inmunogenicidad de mimotopos del VHA obtenidos mediante la tecnología de expresión en fagos al ser inmunizados ratones Balb/c. Diferentes diluciones de anticuerpos se incubaron con 10³ o 10² Dosis Infecciosas en Cultivo de Tejidos 50 por ciento (DICT50) del clon citopàtico HM175/18f de VHA, y se inocularon en placas con células FRhK4. Después de 7 días de incubación el título neutralizante se determinó como el recíproco de la dilución del suero capaz de reducir la multiplicación viral al 50 por ciento. Tanto 10³ como 10² DICT50 fueron neutralizadas por el anticuerpo monoclonal 7E7 y los sueros humanos (A12 y A31) positivos a anticuerpos anti-VHA. Los controles negativos del ensayo no neutralizaron al virus. Los títulos neutralizantes de los sueros de ratones inmunizados con fagos portadores de mimotopos de VHA oscilaron entre 4 y 16, mientras que los sueros preinmunes y los de ratones inmunizados con fago salvaje M13 no neutralizaron la infectividad viral. Este ensayo de neutralización resultó adecuado para la evaluación de los inmunógenos propuestos(AU)

Immunity to hepatitis A virus (HAV) is in first instance due to neutralizing antibodies. Neutralization assays are essential to evaluate new candidate vaccines against this pathogen. In this paper, an in vitro neutralization assay to evaluate HAV vaccine candidates using phage-display technology is described. 10³ and 10² DICT50 of HAV were incubated with different antibodies preparations and were inoculated onto plates with FRhK4 cells. After seven days of incubation, the neutralizing titer was determined as reciprocal of the serum dilution reducing HAV growth (inhibition of CPE) by 50 percent. 10³ and 10² DICT50 were neutralized by 7E7 anti-HAV monoclonal antibody and anti-VHA positive human sera (A12 and A31). Negative controls of the assay did not neutralize viral infectivity. Sera from mice immunized with phages displaying VHA mimotopes had neutralizing titers from 4-16. Neither negative control nor pre-immune and sera from mice immunized with M13 wild type phage neutralized HAV. A simple and faster in vitro neutralization assay was developed to evaluate new HAV vaccine candidates(AU)

Identification of Dengue-specific B-Cell Epitopes by Phage-display Random Peptide Library.

BACKGROUND: Dengue is the most important human viral disease transmitted by arthropod vectors. The availability of random peptide libraries (RPL) displayed on phage has provided a powerful tool for selecting sequences that mimic epitopes from microorganisms that are useful for diagnostic and vaccine development purposes. In this paper, we describe peptides that resemble the antigenic structure of B-cell epitopes of dengue virus identified from a phage-peptide library using human sera containing polyclonal antibodies against dengue virus. MATERIALS AND METHODS: Eighteen phage clones were isolated from the phage-display peptide library, J404, by affinity selection using human antisera against dengue virus type 3. These clones were tested for reactivity by ELISA with a panel of hyperimmune ascitic fluids (HAFs) containing antibodies either against all four dengue serotypes, West Nile virus (WNV) or Eastern equine encephalitis virus (EEEV) with control ascitic fluid (NAF) used as a negative control. RESULTS: Eight clones were recognized by HAFs against the four dengue serotypes, of which four significantly inhibited binding of anti-dengue antibodies to the virus. Two peptides with similar sequences to regions of NS3 and NS4B non-structural dengue virus proteins were identified. CONCLUSION: Our results suggest that these peptides could be used for the development of diagnostic tools for the detection of dengue virus infection and for a potential vaccine against this pathogen.

Identification of hepatitis A virus mimotopes by phage display, antigenicity and immunogenicity.

A phage-displayed peptide approach was used to identify ligands mimicking antigenic determinants of hepatitis A virus (HAV) for the first time. Bacteriophages displaying HAV mimotopes were isolated from a phage-display peptide library by affinity selection on serum antibodies from hepatitis A patients. Selected phage-peptides were screened for reactivity with sera from HAV infected patients and healthy controls. Four cloned peptides with different sequences were identified as mimotopes of HAV; three of them showed similarity in their amino acid sequences with at least one of the VP3 and VP1 antigenic proteins of HAV. One clone was recognised by 92% of the positive sera. The phagotopes competed effectively with HAV for absorption of anti-HAV-specific antibodies in human sera, as determined by ELISA. The four phage clones induced neutralising anti-HAV antibodies in immunised mice. These results demonstrate the potential of this method to elucidate the disease related epitopes of HAV and to use these mimotopes in diagnostic applications or in the development of a mimotope-based hepatitis A vaccine without the necessity of manipulation of the virus.

Influenza: vacunas clásicas y novedosas a las puertas de otra pandemia / Influenza. Classic and novel vaccines on the verge of another pandemic

Los virus de la influenza A, además del hombre, infectan otros mamíferos y una gran variedad de especies de aves. Desde 1997 se sabe que cepas aviares son capaces de infectar al hombre provocando una enfermedad generalmente leve. El brote actual de gripe aviar H5N1 en humanos ha puesto en alerta a la comunidad científica internacional, no solo por su elevada mortalidad sino por su potencialidad en la generación de una nueva pandemia. Las autoridades sanitarias han puesto en marcha un amplio programa para la preparación ante esta contingencia, que abarca diferentes campos, desde el diagnóstico y la detección precoz de los brotes tanto en animales como en humanos, la caracterización sistemática de las cepas circulantes, el sacrificio de aves infectadas, la producción masiva de antivirales y por supuesto el desarrollo y producción a gran escala de vacunas eficaces. En este último tema se trabaja intensamente tanto en el mejoramiento de las vacunas ya existentes como en la búsqueda de alternativas basadas en tecnologías denueva generación(AU)

Amplificación dependiente de anticuerpos del virus dengue en cepas cubanas utilizando anticuerpos monoclonales / Dengue virus antibodies dependent amplification in Cuban strains by using monoclonal antibodies

Se describieron los diferentes comportamientos de anticuerpos monoclonales anti-dengue serotipo 2 (H3/6, 4G3) y anti-proteína recombinante de la envoltura del virus dengue cuando fueron enfrentados a diferentes cepas de los serotipos 2 y 4 de este virus (D2 Nueva Guinea C, A15 cepa cubana y A15 propagada 53 veces en cultivo de riñón de perro Beagly y D4 H-2412 cepa prototipo) en un ensayo de inmunoamplificación dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales han demostrado ser una herramienta eficaz para explicar que la neutralización y el incremento de la multiplicidad viral pueden realizarse como funciones biológicas separadas. Solamente el AcM H3/6 fue capaz de producir el fenómeno amplificación dependiente de anticuerpos frente a la cepa A15 con un incremento significativo en la multiplicación viral. Los AcMs 4G3 y 4B6 no fueron capaces de inmunoamplificar la multiplicación viral de las cepas estudiadas(AU)

Amplificación dependiente de anticuerpos del virus dengue en cepas cubanas utilizando anticuerpos monoclonales / Dengue virus antibodies dependent amplification in Cuban strains by using monoclonal antibodies

Se describieron los diferentes comportamientos de anticuerpos monoclonales anti-dengue serotipo 2 (H3/6, 4G3) y anti-proteína recombinante de la envoltura del virus dengue cuando fueron enfrentados a diferentes cepas de los serotipos 2 y 4 de este virus (D2 Nueva Guinea C, A15 cepa cubana y A15 propagada 53 veces en cultivo de riñón de perro Beagly y D4 H-2412 cepa prototipo) en un ensayo de inmunoamplificación dependiente de anticuerpos. Los anticuerpos monoclonales han demostrado ser una herramienta eficaz para explicar que la neutralización y el incremento de la multiplicidad viral pueden realizarse como funciones biológicas separadas. Solamente el AcM H3/6 fue capaz de producir el fenómeno amplificación dependiente de anticuerpos frente a la cepa A15 con un incremento significativo en la multiplicación viral. Los AcMs 4G3 y 4B6 no fueron capaces de inmunoamplificar la multiplicación viral de las cepas estudiadas.

The different behaviors of antidengue monoclonal antibodies serotype 2 (H3/6, 4G3) and antiprotein recombinant from the dengue virus sheath were described when they faced diverse strains from the serotypes 2 and 4 of this virus (D2 New Guinea C, A15 Cuban strain and A15 propagated 53 times in culture of Beagley dog kidney and D4 H-22412 prototype strain) in an immunoamplification assay dependent of antibodies. Themonoclonal antibodies have prove to be an efficient tool to explain that the neutralizatrion and increase of viral multiplicity may be carried out as separate biological functions. Only the H3/6 monoclonal antibdoy was capable of producing the amplification assay dependent phenomenon against the A15 strain with a significant rise in the viral multiplication. The 4G3 and 4B6 monoclonal antibodies were not capable of immunoamplifying the viral multiplication of the studied strains.

Vacunas contra el virus dengue: desarrollo histórico / Vaccines against dengue virus: History

La Fiebre del Dengue (FD) y la Fiebre Hemorrágica del Dengue (FHD) han emergido como la principal enfermedad viral trasmitida por artrópodos que afecta al hombre. Las características de la enfermendad, la ausencia de drogas antivirales contra la misma, el incremento en el número de enfermos, de países afectados y la dificultad para el control del vector han convertido el desarrollo de vacunas contra el dengue en una prioridad para la salud pública mundial(AU)

Actividad antiviral de la lactoferrina de calostro humano contra el virus Herpes simple tipo 1 / Antiviral activity of human colostral lactoferrin against herpes simplex virus type 1

En el presente trabajo se evaluan la citotoxidad y actividad de una preparación local de lactoferrina de calostro humano para determinar su inocuidad y la actividad bilógica. en el modelo VHS-1 /células Vero, sta preparación de lactoferrina mostró una actividad antiviral significativa contra VHS-1 con parámetros (CC50-54,3uM, ED50 1,4uM, SI-39) Similares a los reportados para otras preparaciones comerciales de lactoferrina humana. Esta preparación de lactoferrina inhibió la actividad hemaglutinante del VHS-1 en eritrocitos de ratón. Se muestra por primera vez, que la actividad antiviral de la lactoferrina y la heparina contra VHS-1 se anulan, si ambas sustancias se mezclan antes de la infección viral(AU)

Aplicación de métodos moleculares al diagnóstico y caracterización de una epidemia de dengue en Cuba / Application of molecular methods to the diagnosis and characterization of a dengue outbreak in Cuba

Despúes de un período de 16 años sin dengue en Cuba, los primeros casos clínicos fueron detectados en general en enero de 1997 en Santiago de Cuba mediante vigilancia epidemiológica activa con asistencia de laboratorio. Se realizó transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa/reacción en cadena de la polimerasa anidada (TI-RCP/RCP anidada) para la indentificación rápida del virus del dengue serotipo 2 (DEN-2) como agente etiológico...(AU)

Aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para la / titulación de cepas del virus Dengue 1 / Use of the immunoperoxidase technique for the titration of a Dengue 1 virus strain

La aplicación de la técnica de inmunoperoxidasa para titular virus Dengue ha permitido eliminar algunas de lasdesventajas que presenta, para este mismo fin, la técnica de formación de placas en cultivos celulares,catalogada como un método fastidioso debido a los múltiples factores que influyen en la formación de las placas. En la literatura consultada se reporta la disminución del tiempo para la obtención de los resultados como la principal ventaja de la primera, pero no datos sobre su precisión. Teniendo esto en cuenta nos propusimos aplicar dicha técnica para titular virus Dengue 1. Se siguió el procedimiento descrito para realizar la inmunoperoxidasa modificando el tiempo de fijación de las células infectadas de 5, 7 y 10 días y el bloqueo con TSF-Tween 20- SAB 1(por ciento) durante una hora. La dilución de trabajo para el suero humano utilizado fue de 1/500 y para el líquido ascítico hiperinmune de ratón, contra Dengue 1 fue de 1/100; para los conjugados peroxidasa anti humano y anti ratón empleados, resultaron útiles diluciones de 1/100 y 1/200 para el primero y 1/500 y 1/1000 para el segundo. Se evidenciaron los focos de infección viral, al 7° y 10° días, pero no al 5º. Los títulos virales obtenidos por dos operadores presentaron un Coeficiente de Variación < 30(por ciento). Se seleccionó el 7º día para titular el virus, lográndose reducir el tiempo requerido para obtener los resultados con la técnica de placas.No hubo diferencias significativas entre los títulos virales calculados por ambas técnicas(AU)

Meningoencefalitis por Enterovirus en los últimos 5 años / Meningoencephalitis due to Enterovirus in the last five years

Se describen los resultados del estudio de Enterovirus como agentes productores de meningoencefalitis viral, desde 1990 hasta 1994. Fueron estudiados en este período 546 muestras de heces fecales, 95 líquidos cefalorraquídeos y 1 058 sueros pareados, obtenidos de 1 388 pacientes diagnosticados clínicamente con esta enfermedad. Las muestras para aislamiento viral se inocularon en 2 sistemas celulares diferentes, el mayor número de aislamiento se encontró en células diploides de fibroblasto humano. Las determinaciones de anticuerpos se realizaron por prueba de neutralización (micrométodo) con 11 antígenos de Enterovirus (Echo 4,6,9,11 y 30 y Coxsackie B1,2,3,4,5 y 6) y en períodos epidémicos con el virus aislado. En los años estudiados se produjeron 2 brotes epidémicos; uno por Coxsackie A9 (1990-1991) y otro por Echo 30 (1994). En los sueros pareados se encontró mayor positividad a los Echo 6 y 11(AU)

Meningoencefalitis por Enterovirus en los ultimos 5 anos / Meningoencephalitis due to Enterovirus in the last five years

Se describen los resultados del estudio de Enterovirus como agentes productores de meningoencefalitis viral, desde 1990 hasta 1994. Fueron estudiados en este periodo 546 muestras de heces fecales, 95 liquidos cefalorraquideos y 1 058 sueros pareados, obtenidos de 1 388 pacientes diagnosticados clinicamente con esta enfermedad. Las muestras para aislamiento viral se inocularon en 2 sistemas celulares diferentes, el mayor numero de aislamiento se encontro en celulas diploides de fibroblasto humano. Las determinaciones de anticuerpos se realizaron por prueba de neutralizacion (micrometodo) con 11 antigenos de Enterovirus (Echo 4,6,9,11 y 30 y Coxsackie B1,2,3,4,5 y 6) y en periodos epidemicos con el virus aislado. En los anos estudiados se produjeron 2 brotes epidemicos; uno por Coxsackie A9 (1990-1991) y otro por Echo 30 (1994). En los sueros pareados se encontro mayor positividad a los Echo 6 y 11